해양 발광세균, Vibrio fischeri의 공생 및 생태적 특징

이 규호
한국외국어대학교 자연과학대학 환경학과
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< 목 차 >

1. 서론

2. Vibrio fischeri의 발광의 특징

3. Vibrio fischeri-Euprymna scolopes 공생의 특징

4. Vibrio fischeri의 공생에 따른 생태적 특징

4-1. 수계 내 존재하는 culturable V. fischeri의 탐지

4-2. non-culturable but viable V. fischeri의 존재

4-3. V. fischeri 개체군간의 공생을 위한 경쟁

4-4. 여러 지역에 분포하는 V. fischeri 개체군의 genetic diversity

5. 결론 및 전망

6. 참고문헌




1. 서론

발광세균 (luminous bacteria)이란 주로 해양에 서식하며 빛을 발하는 능력 (bioluminescence)을 가진 세균들의 일반적인 group이다. Vibrio fischeri, V. harveyi, Photobacterium phosphoreum, 그리고 P. leiognathi 들이 주된 luminous bacteria이며, 지역적으로 V. orientalis, V. splendidus, V. logei, V. vulnificus, 그리고 Shewanella hanedai가 소수를 이룬다. 해양 이외의 생태계로서, 담수에서는 luminous V. cholerae non-01이 특별한 계절에 종종 발생되는 것으로 보고되고 있으며, 토양에서는 Xenorhabdus (또는 Photorhabdus)가 발견된 바 있다. 이 중에서 V. fischeri, P. leiognathi, P. phosphoreum, 그리고 아직 동정되지 못한 (uncultarable) luminous bacteria는 squid, fish, 그리고 tunicate의 발광기관 (light organ)에서 서식하며 mutualistic symbiosis를 하고 있다. light organ 공생 외에도 해양 luminous bacteria는 planktonic, epiphytic, parasitic, saprophytic하게 분포하는 등 매우 다양한 life style을 갖고 있다. 해양 luminous bacteria는 여러 종류의 life style로 존재하는 그들이 전형적인 계절적, 해양학적 변화 [예를 들면, 바닷물의 온도, 염분도, 영양분의 농도, 그리고 photo-oxidation 등]에 의해서 영향을 받는다는 점, 그리고 그들이 다른 생명체와 associated form [예를 들면, light organ, gut tract, 표피 등]으로도 존재한다는 특징으로 인하여 비교적 많은 생태 및 생리학적 연구 대상이 되어 왔다 [12].




2. Vibrio fischeri의 발광의 특징

전통적으로 luminous bacteria의 연구는 암실 하에서 빛을 발하는 colony들을 추출하고 동정함으로써 이루어져 왔다. 이러한 방법으로 바다물에서 추출된 luminous colony 중의 약 10-50%를 이루는 V. fischeri의 경우, bioluminescence에 필요한 효소 및 조절인자는 lux라는 operon으로부터 만들어지는데, 이 operon은 8개의 유전자 (luxRICDABEG)로 구성되어 있다 [10]. Luciferase (LuxAB)는 산소가 있는 상태에서 long-chain aldehyde를 substrate로 이용하여 fatty acid로, 그리고 FMNH2를 FMN으로 산화시키는 dioxygenase의 기능을 한다. FMNH2가 FMN으로 되는 중간 과정에서 생긴 electronically excited flavin으로부터 490nm의 빛이 나오게 된다. 이러한 발광반응의 산물인 fatty acid는 acid reductase complex (LuxCDE)에 의해 aldehyde로, 그리고 FMN은 flavin reductase (LuxG)에 의해 FMNH2로 환원되어 luciferase의 substrate로 재활용 된다.
V. fischeri의 luciferase는 homoserine lactone과 regulatory protein (LuxR)에 의해 그 합성이 조절되는 바, 특이한 점은 그 합성이 cell density에 의해 영향을 받는 소위 정족수인식 기작 (quorum-sensing mechanism)인 것이다 [1]. 즉, V. fischeri의 발광반응은 자신이 합성하여 세포 외부로 배출된 autoinducer (N-3-oxohexanoyl homoserine lactone; VAI-1)가 주위환경에 축적되면서 농도차에 따라 다시 동종 세균의 내부에 확산되어 들어오게 되면서 시작한다. LuxI 단백질은 VAI-1을 합성하는 autoinducer synthase라는 효소이며, LuxR 단백질은 세포내부로 들어온 VAI-1와 binding한 후 발광에 필요한 유전자 및 luxI의 전사를 증진시키는 조절자 (transcriptional activator) 역할을 한다. 따라서 V. fischeri의 정족수인식의 특징은 낮은 세포밀도에서는 발광에 필수적인 luciferase 등을 coding하는 lux operon은 매우 낮은 수준의 전사만이 진행되다가, 개체군의 성장에 의하여 세포의 밀도가 높아지면서 축적되어온 autoinducer가 LuxR과 결합하여 lux operon을 induction 시켜 빛의 발산이 급격히 증가된다는 것이다.
이러한 방식에 의해 V. fischeri는 해양동물의 발광기관 내에서 공생할 때, 즉 자신의 세포밀도가 1010-1011 cells/ml에 이를 때에는 최대 수준의 빛을 발하지만, 바닷물에서 free-living 상태로 1-100 cells/ml 미만의 낮은 세포밀도로 존재할 때에는 충분한 autoinducer가 세포 내에 축적될 수 없으므로 발광에 필요한 유전자들이 발현되지 않는 상태에 있게 된다 [13]. 따라서 생리적 또는 생태적 의의를 갖는 발광이라는 기능을 보이기 위하여 V. fischeri는 반드시 어느 정도 이상의 세포 밀도로 존재할 때만 발광현상이 나타날 수 있게끔 하는 조절장치를 구비하고 있다.




3. Vibrio fischeri-Euprymna scolopes 공생의 특징

V. fischeri는 오징어의 한 종류인 Euprymna scolopes (Figure 1; 9)와 species-specific한 공생관계에 있다고 알려져 있다 [13]. Euprymna scolopes는 하와이에서만 발견되는 sepiolid squid로서 섬 주위의 reef 환경에서 살고 있는데, 이 squid는 reef flat에 알을 낳고, 유체는 3주 후에 부화되며, 근처의 환경에서만 성체로 발달되어 지는 바, 그들의 모든 life cycle이 한 곳의 비교적 좁은 niche에 한정 (endemic) 되어있다 [7]. E. scolopes는 nocturnal behavior 시 counter-illumination (predator의 시선을 피하기 위한 빛의 이용)을 위해 빛이 필요하다. 이를 위하여 많은 수의 V. fischeri를 자신의 체내에 위치한 light organ (Figure 2; 8)에 존재하게 하므로서 빛을 얻는다 [8].
알에서 갓 부화한 유체는 symbiont를 갖고 있지 않는 aposymbiotic 상태이며, 24시간 내에 주변에 분포한 symbiotic V. fischeri에 의해 infection이 일어나며, 그 후 symbiont는 20분의 doubling time으로 빠르게 증식하며 light organ 당 105 - 106 cell 까지 늘어난다. 이 후에는 약 12시간의 doubling time으로 천천히 증식하며, squid가 자라면서 light organ의 크기가 커지며, 따라서 symbiont의 수도 성체 (8-12mm의 mantle 길이)의 경우 108 - 109 cell에 이른다. 이들의 공생관계는 매우 specific하여, 오로지 V. fischeri에 의해서만 light organ의 infection이 일어나며, 주위 바닷물에 분포한 V. harveyi나 P. leiognathi 등은 이 squid의 light organ 내에서 찾아 볼 수가 없다 [8].
이렇듯 매우 높은 수의 symbiont (약 109 cells/squid 또는 1011 cells/ml of light organ fluid)에게 host squid가 영양분 및 산소 등을 계속 제공하는 일은 아마도 꽤 부담스러운 일인 듯 싶다. host는 거의 대부분의 낮 시간은 모래 속에 파뭍혀 있고 밤에만 luminous bacteria의 존재가 필요하므로 host는 해가 뜨면 이른 새벽에 circradium rhythm의 일환으로 약 95% 이상의 symbiont를 light organ의 pore를 통해서 배출하므로써, 낮에는 불필요한 영양 공급을 줄일 수 있으며, 남아 있는 약 5%의 symbiont population은 평균 5시간의 doubling time으로 다시 109 cell 수치까지 증가한다. 즉, 한 마리의 성체 squid 당 약 5×108 V. fischeri cell이 매일 아침 squid habitat의 주위 환경으로 배출된다 [4]. 또한 배출된 V. fischeri는 적어도 배출된 후 24시간 내에는 9-13시간의 doubling time으로 그 수가 증식되므로 squid의 서식지는 symbiotic V. fischeri로 매우 enrich될 것임을 쉽게 짐작할 수 있다. 다른 시각에서 이 현상을 보자면 host squid인 E. scolopes는 symbiont 없이는 정상적인 발달과정을 밟을 수 없으므로 정상적인 squid의 life cycle을 위해서도 많은 수의 symbiosis-competent V. fischeri가 절대적으로 필요하다 [8].




4. Vibrio fischeri의 공생에 따른 생태적 특징

4-1. 수계 내 존재하는 culturable V. fischeri의 탐지

특이하게도 E. scolopes에 공생하는 V. fischeri는 light organ 내에서는 다른 luminous bacteria와 같이 밝은 빛을 내지만 light organ 밖의 배양에서는 우리의 눈으로 탐지할 만큼 빛을 내지 못한다 (non-visibly luminous). 그러므로 E. scolopes의 서식처로부터 채취된 시료를 plating 한 후 colony를 암실에서 관찰하여 밝은 빛을 내는 colony를 찾는 방법으로는 이 symbiotic bacteria를 동정할 수 없다. 따라서 하와이 바닷물에 있는 모든 V. fischeri의 CFU를 파악하기 위해서 V. fischeri에만 특이하게 존재하는 DNA probe를 사용한 colony hybridization이라는 방법이 이용되었다.
여러 가지의 V. fischeri 유전자 중에서 luxA 또는 luxR이 V. fischeri를 다른 종의 해양 세균이나 유사한 iuminous bacteria로부터 구분하는데 매우 용이함이 밝혀졌다 [2]. 이 방법으로 약 4년간의 조사로 부터 E. scolopes의 habitat에는 V. fischeria가 약 200 CFU/100ml 농도로 존재함이 밝혀졌다. 이 수치는 E. scolopes가 서식하지 않는 주변지역의 바닷물이나 sediment에서 보다 24-30배가 많은 양이다 [4]. 또한 V. fischeri의 양은 그 habitat로부터의 거리에 비례해서 줄어듦이 보여졌다 [4]. 이와 같이 많은 양의 V. fischeri가 host의 서식지에 존재함은 다른 지역과의 물리, 화학적으로 다른 parameter에 의해서가 아닌 오직 공생이라는 V. fischeri와 E. scolopes간의 관계에 의해 결정됨이 밝혀졌다. 그러므로 한 종의 세균이 생물학적인 요인에 의해 그 생태가 결정되는 현상이 바로 symbiotic bacteria인 V. fischeri와 그의 공생숙주인 하와이 squid에 의해 처음으로 보여진 예가 되는 것이다 [4, 12].
갓 부화한 유체를 다른 지역의 바닷물에 incubation하면 유체는 aposymbiotic 상태로 있으나, 이를 squid habitat의 바다물 (2 V. fischeri CFU/ml를 포함하는)에 3시간 정도만 incubation을 하여도 infection process가 진행된다. 또 이 바닷물을 10배 희석한 (따라서 0.2 V. fischeri CFU/ml를 포함하는) 물도 infection을 일으킨다. 그렇지만 실험실에서 수행된 infection 실험의 경우에는 100%의 성공률의 infection을 얻기 위해선 적어도 240 V. fischeri CFU/ml의 concentration을 필요로 한다 [6]. 이 수치는 자연계에 발견된 2 CFU/ml에 비해 100 배나 많은 양이다. 이러한 큰 차이는 어쩌면 culturable한 V. fischeri 만을 찾을 수 있는 colony hybridization 방법으로는 바다물에 존재하는 모든 V. fischeri의 수를 알아낼 수 없다는 문제점을 나타내 주는 듯하다.

4-2. non-culturable but viable V. fischeri의 존재

실제로 Vibrio sp.가 자연 환경상태나 stress condition 하에서 dormant 또는 살아있지만 실험실 culture로는 colony를 못 만드는 (non-culturable but viable: NCBV) 상태로 들어가는 현상이 종종 관찰되었다. 만약 이런 현상이 Hawaii에 있는 symbiotic V. fischeri에도 일어났다면, 우리는 cell-growth가 필요 없이 그 수를 측정할 수 있는 방법이 필요할 것이다.
따라서 바닷물에 있는 모든 세균들을 filter상에 concentration 시킨 후, V. fischeri에만 specific 한 luxA gene probe를 이용한 quantitative DNA-DNA hybridization을 한 결과 약 200-400 V. fischeri cells/ml가 측정되었다 [6]. cell-growth가 필요없는 두 번째의 방법으로서 V. fischeri의 luxA에만 specific한 primers를 사용하여 1개 copy의 V. fischeri genomic DNA에서도 luxA를 증식시킬 수 있는 polymerase chain reaction (PCR) 조건을 만든 다음 1 ul의 바닷물을 PCR의 template로 사용하였다. 만약 이 1 ul의 물에 V. fischeri가 있다면 luxA가 증식될 것이며 이것의 여부를 most-probable-number (MPN) 방법으로 조사한 결과 약 500-700 V. fischeri cells/ml의 농도로서 colony hybridization의 결과보다 수백 배나 많은 수치가 측정되었다[6]. 아울러 symbiotic V. fischeri가 숙주로부터 배출 될 때는 100%가 culurable하지만 주변의 바닷물이나 sediment로 들어가면서 며칠 이내에 non-culturable한 생리적 상태가 되는데 이들은 계속 infection의 능력을 유지됨이 밝혀졌다 [6].
그러므로 E. scolopes의 서식처에 존재하는 거의 대부분의 V. fischeri는 NCBV 상태이며, 이들이 부화된 유체에 infection을 일으키는 주된 inoculum source가 된다고 추측 되어진다. Light organ 공생은 결과적으로 NCBV 상태의 V. fischeri를 culturable 상태로 전환시키는 생태학적 고리 (ecological cycle)에서 중요한 pathway가 되는 것이다.

4-3. V. fischeri 개체군간의 공생을 위한 경쟁

앞서 언급한 바와 같이 squid의 서식처에는 두 가지 phenotype의 V. fischeri가 발견되었다. 빛을 내지 못하는 (non-visibly luminous: NVL) 다수의 symbiont와 소수를 이루는 전형적으로 밝은 빛을 내는 (visibly luminous: VL) V. fischeri 이다. 지금까지 5-6년간의 조사에서 단지 NVL V. fisheri만이 E. scolopes의 공생상대가 됨이 알려졌다.
그렇지만 VL V. fischeri도 pure culture 상태로 E. scolope의 유체를 infection하는 정도나 kinetic은 NVL의 그것과 전혀 차이가 없다 [3]. 또한 VL V. fischeri의 cellular morphology [flagallum 구조]나 physiology [siderpore 생성]도 NVL과의 차이가 없었다. 그러나 VL과 NVL를 함께 infection을 시킬 경우, 시간이 지날수록 light organ 내의 NVL/VL의 비율이 점점 높아지며 4-5일 후에는 거의 대부분의 light organ 내에 생존하는 V. fischeri가 NVL이다 [3]. 이 competition 현상은 아마도 숙주가 공급하는 영양분 중 특이한 것이 있어서 NVL가 VL보다 더 효과적으로 이용함으로써 빨리 번식하며 경쟁에서 이길 수 있다고 여겨진다 [12].
즉, 하와이에는 적어도 두 가지의 다른 V. fischeri population이 공존하는데 하나는 planktonic과 symbiotic phase를 갖는 NVL-population이며, 다른 하나는 symbiosis와는 상관없이 planktonic phase만을 갖는 VL-population이다. 한가지 종 내에 유전학적 다양성 (genetic diversity)의 정도는 geographical separation과 niche specialization이란 두 가지의 생태적 요인에 의하여 결정되지만, 세균의 population genetics에 대한 그들의 상대적인 영향에 대해서는 많이 알려져 있지 않다.

4-4. 여러 지역에 분포하는 V. fischeri 개체군의 genetic diversity

V. fischeri는 Hawaii 뿐 아니라 모든 해양에 살고 있으며, squid 외에도 이와는 진화적으로 다른 기원과 생리적 특징이 다른 fish의 light organ에도 공생관계를 맺고 있다 [11]. 그러므로 V. fischeri라는 종 내의 생태학적 다양성을 반영하는 유전적으로 다른 subgroup이 존재하는지를 알기 위해서, V. fischeri를 여러 지역의 바닷물에서 (하와이, Massachusetts [대서양], 그리고 California)에서 그리고 squid light organ (E. scolopes [하와이]와 E. morsei [일본])와 그리고 fish의 light organ (Monocentris japonica [일본]과 Cleidopus gloriamris [호주])에서 채취하였다. 여러 종류의 유전자를 PCR을 이용 각 V. fischeri isolate로부터 얻은 후 restriction fragment length polymophism (RFLP)으로 그들의 유전적 연관도를 연구하였는데, 이 원리는 진화적인 연관성 (evolutionary relatedness)은 유전적인 변이 (genetic variation)와 반비례하며, 각 strain의 divergency 정도는 DNA 제한 효소의 recognition site의 유.무에 의해 비교적 쉽게 추론할 수 있다는 것이다. 모두 6개의 V. fischeri의 loci (argS, gap, luxA, cpdP, luxRI, toxRS)의 연구로부터 매우 흥미로운 결과가 보고되었다 [5, 12].
하와이에 살고 있는 squid의 light organ symbiont는 그 주위의 바닷물에 다수로 존재하는 planktonic V. fischeri (NVL)와 같은 clade를 보여주었다. 이것은 NVL V. fischeri의 planktonic/symbiotic phase의 계속적인 교환을 증명해 준다. 또한 이들의 restriction fragment (RF) 유형은 일본의 squid (E. morsei)의 light organ에 있는 V. fischeri와 매우 유사하나, 일본의 fish (M. japonica)의 light organ V. fischeri와는 다른 유형을 보여준다. M. japonica의 V. fischeri는 호주의 fish (C. gloriamaris)의 symbiont와 같은 clade를 구성하며, 여기에는 Massachusetts의 planktonic V. fischeri와 하와이에 있는 VL V. fischeri도 속해있다 [5]. California V. fischeri는 위의 모든 isolate와는 상당히 다른 RF 유형을 보이는데 재미있게도 이 clade의 V. fischeri는 squid와 공생관계를 갖지 못한다. 그러므로 V. fischeri 내에는 유전적으로 비교적 다양한 population이 존재하며, V. fischeri의 symbiotic niche는, 적어도 그 균의 지리적 기원 (geographical orgin) 못지 않게, 그들의 유전적인 연관성을 결정지어 준다 하겠다 [12].




5. 결론 및 전망

Luminous bacteria는 여러 측면에서 즉, 생화학적, 생리적, 생태학적으로 가장 많이 공부가 되어온 해양 미생물 중의 하나이다. 그러나 아직도 그들의 기본적이며 궁극적인 측면들은 우리의 지식과는 멀리 놓여진 듯 하다. 왜 빛을 내도록 진화가 되어 왔으며, 여러 환경 하에서 어떻게 그 조절 기작이 발현되며, 공생관계 시 숙주동물과의 signal transduction을 위한 molecular interaction은 언제 어떻게 일어나는지 등의 질문에 대한 충분한 해답은 아직 없다. 그러나 V. fischeri-E. scolopes의 공생관계에 대한 연구는, 생태학적인 결과 외에도, 실험실에서 squid의 life-cycle을 쉽게 유지시킬 수 있으며 여러 population의 V. fischeri와 infection 실험 등이 용이하므로 bacteria와 동물간의 상호관계를 심도있게 연구할 수 있을 듯 하다. 즉 Rhizobium-legume과의 관계에서 미생물-식물간의 중요한 점들이 밝혀졌듯이, V. fischeri-E. scolopes와의 관계가 동물과 미생물간의 specificity의 결정요인, 상호 정보교환 (signal transduction) 기작, 두 개체의 발달과정과 co-evolution, mutualism과 pathogenecity와 차이 등의 연구에 유용히 쓰일 수 있는 model system으로서의 역할을 할 수있을 것이다 [11].




6. 참고문헌

1. Jeon, E.-K., H.-R. Ahn, K.-J. Park, and K.-H. Lee. 1999. 세균의 적정 밀도 인식 기작에 관여하는 조절자군의 특징. Kor. J. Microbiol. 35:99-106.

2. Lee, K.-H., and E. G. Ruby. 1992. Detection of the light organ symbiont, Vibrio fischeri, in Hawaiian seawater by using lux gene probes. Appl. Environ. Microbiol. 58:942-947.

3. Lee, K.-H., and E. G. Ruby. 1994. Competition between Vibrio fischeri strains during initiation and maintenance of a light organ symbiosis. J. Bacteriol. 176:1985-1991.


4. Lee, K.-H., and E. G. Ruby. 1994. Effect of the squid host on the abundance and distribution of symbiotic Vibrio fischeri in nature. Appl. Environ. Microbiol. 60:1565-1571.

5. Lee, K.-H., K. M. Gray, and E. G. Ruby. 1994. Genetic diversity among symbiotic and planktonic isolates of Vibrio fischeri. Abstract 94th Annual Meeting of American Society for Microbiology. 94:239.

6. Lee, K.-H., and E. G. Ruby. 1995. Symbiotic role of the viable but nonculturable state of Vibrio fischeri in Hawaiian coastal seawater. Appl. Environ. Microbiol. 61:278-283.

7. McFall-Ngai, M. J. 1998. Pioneering the squid-Vibrio model. ASM News. 64:639-645.

8. McFall-Ngai, M. J., and E. G. Ruby. 1991. Symbiotic recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science 254:1491-1494.

9. McFall-Ngai, M. J., and E. G. Ruby. 1998. Sepiolids and vibrios: When first they meet. Bioscience 48:257-265.

10. Meighen, E. A. 1994. Genetics of bacterial bioluminescence. Annu. Rev. Genet. 28:117-139.

11. Ruby, E. G. 1996. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50:591-624.

12. Ruby, E. G., and K.-H. Lee. 1998. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ association: current ecological paradigms. Appl. Environ. Microbiol. 64:805-812.

13. Ruby, E. G., and M. J. McFall-Ngai. 1992. A squid that glows in the night: Development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174:4865-4870.

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